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病毒定制服务

慢病毒定制化服务

文字:[大][中][小] 手机页面二维码 2016/9/14     浏览次数:    

慢病毒定制化服务

慢病毒载体的特点和载体介绍

  人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus (HIV, lentivirus) type-1 )载体在实际应用中有较多的优点,比如说它们能感染非分裂期的细胞,整合到基因组中实现长时间的基因表达,滴度比原逆转录病毒体系更好, 免疫反应小等优点。 慢病毒载体还具有转移的基因片段容量较大( 9 kb) ,绝大多数。 由于病毒载体删除了包装基因和外壳蛋白后,我们的病毒载体是缺陷型的病毒,它不能在宿主细胞增殖,也不会导致细胞的死亡,被它感染的细胞能够连续传代。

 

慢病毒服务项目

1)基因及长链非编码RNA( LncRNA)表达研究

   可满足CDS长度长达5K的真核基因或LncRNA转化需求;根据实验目的需要选择GFP/mCherry/CFP/YFP/tdTomato/FLAG融合表达并携带Puromycin抗性筛选标记。 

  2) RNA干扰和microRNA表达研究

      利用U6或H1启动子进行小RNA的表达,以实现基因的RNA干扰以及microRNA的表达。可根据实验目的选择添加Puromycin抗性/Hygromycin抗性/RFP/GFP标记或者同时采用抗生素和荧光标记。 

3)组织表达特异性及转录活性调节研究

     将目的启动子或作用元件与Luc/GFP/CFP/LacZ连接,在组织或细胞水平进行表达活性和转录因子调节效率检测。 

  4) IPS构建制备研究

     利用已构建的人、大鼠和小鼠OCT4, SOX2, Klf4和c-Myc过表达慢病毒,共感染目的细胞,进行IPS的构建和制备。

 

慢病毒颗粒生产包装步骤

  第一步: 是把外源基因克隆进合适的载体。 大多数情况下,外源基因被克隆到一个包含 LTR/MCS 的载体中( pLOV.CMV.GFP 或类似载体,以下的说明中以 pLOV.CMV.GFP 为例)。这些载体中长末端重复( LTR)序列, psi 序列, RRE 序列, cppt 序列是包装必须的顺式作用元件。

第二步: 重组表达质粒同 psPAX2 包装质粒和 pMD2.G(外膜质粒)共转染进 293T 细胞。 转染 2 到 3 天后重组病毒颗粒在包装细胞中组装完成,并分泌到培养基上清中。 

第三步: 回收培养上清,并用离心将细胞碎片除去,再用 0.45μM 的滤膜过滤,准备用于浓缩。 

第四步: 用超速离心机 100000g (约为 30000 转) 离心 2 小时,去掉上清。沉淀用 200μl DMEM 或 Opti-MEME(invitrogen)溶解。
  第五步: 将得到的病毒用 0.22μM 孔径的滤膜过滤,除去大的颗粒杂质,分装后保存于-80℃。
  第六步:用得到的浓缩病毒感染 293T 细胞, 2 天后收集细胞抽提基因组 DNA。 在这个过程中病毒进入细胞,逆转录为 DNA 并插入到了基因组 DNA 上。 

  第七步:用定量 PCR 法测定该基因组中病毒的整合频率,通过这个比例以及原初细胞数和加入的病毒体积可以计算得到病毒的感染滴度。因为只有当病毒具有感染能力时,才能被这种方法检测到,所以这种方法检测的滴度单位是( TU/ml)。

 

浓缩纯化慢病毒

产品名称

病毒滴度

总量

赠送阴性对照病毒规格

过表达慢病毒

>10^8 TU/ml

1ml

1ml(>10^8 PFU/ml)

干扰慢病毒

>10^8 TU/ml

1ml

1ml(>10^8 PFU/ml)

 

体外慢病毒

产品名称

病毒滴度

总量

赠送阴性对照病毒规格

过表达慢病毒

1*10^6~2*10^7TU/ml

10^8 TU

10^8 TU

干扰慢病毒

1*10^6~2*10^7TU/ml

10^8 TU

10^8 TU

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